Cha anh là Lê Hữu Đạt, còn gọi là Lê Khoan, mẹ là Nguyễn Thị Sờm, đều là những Việt kiều sống ở Nakhon; họ gốc của anh vốn là Lê Hữu song đến đời anh thì được đặt thành Lê Văn. Anh có đông anh chị em gồm: Lê Văn Đại, Lê Văn Tăng, Lê Văn Năng, Lê Thị Sáu, Lê Thị Bảy,...
Anh hoạt động trong Hội Thanh niên Cách mạng đồng chí. Năm 1929, Lý Tự Trọng về nước hoạt động với nhiệm vụ thành lập đoàn Thanh niên Cộng sản Hồ Chí Minh và làm liên lạc cho xứ uỷ Nam Kì với Đảng Cộng sản Việt Nam.
Ngày 9 tháng 2 năm 1931, trong buổi mít tinh kỉ niệm một năm cuộc khởi nghĩa Yên Bái tổ chức tại Sài Gòn, khi mật thám đến đàn áp, Lý Tự Trọng đã bắn chết thanh tra mật thám Legrant, để bảo vệ diễn giả Phan Bôi đang diễn thuyết tại quảng trường Lareni, sau đó anh bị bắt giam vào Khám Lớn và bị kết án tử hình ngày 20 tháng 11 năm 1931. Sự việc này làm dấy lên một phong trào đấu tranh mạnh mẽ ở Khám Lớn khiến từ đó cai ngục tại đây luôn gọi Lý Tự Trọng là "Ông Nhỏ".
Lúc ra tòa xét xử. Người thanh niên 17 tuổi ấy đã lấy vành móng ngựa để làm diễn đàn lên án ách thống trị thực dân, kêu gọi nhân dân đứng dậy đấu tranh. Luật sư bào chữa cho anh xin tòa mở lượng khoan hồng vì anh chưa đến tuổi thành niên, đã hành động không có suy nghĩ.
Lý Tự Trọng nói:
"Tôi hành động không phải là không suy nghĩ. Tôi hiểu việc tôi làm. Tôi làm vì mục đích cách mạng. Tôi chưa đến tuổi thành niên thật, nhưng tôi đủ trí khôn để hiểu rằng con đường của thanh niên chỉ có thể là con đường cách mạng và không thể là con đường nào khác. Tôi tin rằng nếu các ông suy nghĩ kĩ thì các ông cũng cần phải giải phóng dân tộc, giải phóng những người cần lao như tôi".
Chánh án tuyên án xử tử anh, Lý Tự Trọng vẫn bình tĩnh. Khi được hỏi anh có ăn năn gì không, anh đứng trước vành móng ngựa, mặt thẳng phía trước chỉ nói một câu: "Không ăn năn gì cả!"
Lý Tự Trọng sống những ngày cuối cùng của cuộc đời mình trong xà lim án chém khám lớn Sài Gòn. Mọi chi tiết về người tù án chém "Trọng con" được gác ngục, chủ khám truyền ra ngoài với một lòng cung kính, khâm phục: "Ông nhỏ ngày nào cũng tập thể dục! Nhìn ông nhỏ sống không ai tưởng tượng được là người đợi đến ngày lên máy chém".
Những án chém đế quốc thường để hàng năm mới đem ra xử. Riêng vụ "Trọng con", một vụ án "đổ nhiều mực" của báo chí thời đó, chưa được 6 tháng đã xử. Bà Angđơrê Viôlít đã viết về giờ phút cuối cùng của Lý Tự Trọng: "Ngày 21/11/1931 thì Huy (tức là Trọng) bị đem xử tử. Sài Gòn hết sức xúc động. Hôm ấy phải ra lệnh thiết quân luật. Từ khám lớn vang ra ngoài đuờng phố, tiếng la hét của tù chính trị. Tiếng thét từ lồng ngực và từ trái tim của họ đã đi theo Huy ra trường chém. Phải điều quân đội và lính cứu hỏa để phun nước đàn áp họ. Trong những tường giam của khám lớn đã xảy ra những chuyện như thế. Trước máy chém, Huy định diễn thuyết, song hai tên sen đầm nhảy xô đến không cho anh nói. Người ta chỉ nghe thấy tiếng anh kêu "Việt Nam! Việt Nam!". Huy cũng như Phạm Hồng Thái, cũng như nhiều người khác, là những anh hùng của nền độc lập Việt Nam".Lý Tự Trọng trước khi lên máy chém mấy lần gọi "Việt Nam" và đã hát nhiều lần bài "Quốc tế ca".
Nhà thờ Lý Tự Trọng được xây trên nền nhà tổ tiên của dòng họ Lê tại xã Thạch Minh, huyện Thạch Hà, tỉnh Hà Tĩnh. Tên của anh đã được đặt cho một giải thưởng của Trung ương Đoàn Thanh niên Cộng sản Hồ Chí Minh dành trao tặng cho thanh niên. Ngoài ra, tên anh cũng được đặt cho nhiều trường học và con đường ở Việt Nam.