Nguyễn Văn Trỗi là con thứ ba (do đó anh còn có tên là Tư Trỗi) trong một gia đình nghèo tại làng Thanh Quýt, xã Điện Thắng, huyện Điện Bàn, Quảng Nam, Việt Nam.
Sau Hiệp ước Genève, gia đình anh vào Sài Gòn sinh sống. Lớn lên, anh làm thợ điện ở nhà máy điện Chợ Quán và tham gia tổ chức Biệt động thành, Đại đội quyết tử cánh Tây Nam Sài Gòn.
Năm 1964, anh được tập huấn cách đánh biệt động nội thành ở căn cứ Rừng Thơm, Đức Hòa (Long An).
Ngày 2 tháng 5 năm 1964, anh nhận nhiệm vụ đặt mìn ở cầu Công Lý, để ám sát phái đoàn quân sự chính trị cao cấp của Chính phủ Hoa Kỳ do Bộ trưởng quốc phòng Robert McNamara dẫn đầu. Nhiệm vụ này ban đầu được giao cho một đồng đội của Trỗi, nhưng anh xung phong đi thay vì vợ chồng người đồng đội đó đã có con. Công việc bại lộ, anh bị bắt lúc 22 giờ ngày 9 tháng 5 năm 1964.
Khu tưởng niệm Nguyễn Văn Trỗi ở gần cầu Công Lý, trên đường Nam Kỳ Khởi Nghĩa, thuộc quận 3, Thành phố Hồ Chí Minh
Chính quyền Việt Nam Cộng hòa đưa anh ra tòa án quân sự kết án tử hình. Nguyễn Văn Trỗi bị xử bắn tại sân sau nhà lao Khám Chí Hòa lúc 9 giờ 45 phút ngày 15 tháng 10 năm 1964, trước sự chứng kiến của nhiều phóng viên nước ngoài. Những phút cuối cùng, anh tỏ ra rất can đảm, không đồng ý bịt mắt và xưng tội và hô lên những lời cuối cùng được các phóng viên ghi lại:
Hãy nhớ lấy lời tôi
Đả đảo đế quốc Mỹ
Đả đảo Nguyễn Khánh
Hồ Chí Minh muôn năm
Hồ Chí Minh muôn năm
Hồ Chí Minh muôn năm!"
(Nguyễn Văn Trỗi)
Chính quyền Việt Nam Cộng hòa bí mật cho chôn xác Nguyễn Văn Trỗi tại nghĩa trang Văn Giáp ở Giồng Ông Tố (nay thuộc phường Bình Trưng Đông, Quận 2, Thành phố Hồ Chí Minh). Sau nhiều ngày tìm kiếm, cha đẻ và vợ anh mới tìm thấy mộ.
Đời tư
Nguyễn Văn Trỗi lập gia đình với chị Phan Thị Quyên năm 1964. Chỉ 19 ngày sau lễ kết hôn thì anh bị bắt. Chị cũng bị bắt sau anh vài ngày nhưng sau đó được thả ra vì không có bằng chứng kết tội. Hai người chưa có con với nhau. Sau khi Nguyễn Văn Trỗi bị xử bắn, chị được các đồng đội của Nguyễn Văn Trỗi đưa ra Bắc học. Năm 1973, chị tái giá với một người bạn học ở ngoài Bắc là Lê Tâm Dũng (Ba Dũng).
Trong nghệ thuật
Trong Văn học, hình tượng Nguyễn Văn Trỗi trở thành cảm hứng, cũng là nhân vật chính trong:
Bài thơ "Hãy nhớ lấy lời tôi" của nhà thơ Tố Hữu có những câu thơ: "Chúng run lên, xông trói chặt Anh hơn/Đôi mắt Anh đã khô cháy căm hờn/Phải chiến đấu như một người cộng sản/Trái tim lớn không sợ gì súng đạn!/Và tay anh giật phắt dải băng đen/ Anh muốn thiêu bằng mắt lũ đê hèn/Chỉ có tất cả chín phút ngắn ngủi, "những phút làm nên lịch sử"
Tập bút kí "Sống như anh" của Trần Đình Vân.
Bài hát về Nguyễn Văn Trỗi với câu hát "Ôi tên anh truyền khắp hoàn cầu. Cuồn cuộn sôi trong muôn con tim - Người du kích châu Mỹ La tinh".
Điện ảnh
Anh Nguyễn Văn Trỗi sống mãi - phim tài liệu, đạo diễn Bùi Đình Hạc.
Nguyễn Văn Trỗi (1966) - phim truyện, đạo diễn Bùi Đình Hạc, Lý Thái Bảo.
Vinh danh
Sau khi chết, Nguyễn Văn Trỗi được truy nhận Đảng viên Nhân dân Cách mạng miền Nam và Mặt trận Dân tộc Giải phóng miền Nam Việt Nam truy tặng Huân chương Thành đồng hạng nhất
Năm 2012, kỷ niệm 48 năm ngày mất, nhà tưởng niệm anh hùng liệt sĩ Nguyễn Văn Trỗi được khánh thành trong khuôn viên nghĩa trang liệt sĩ huyện Điện Bàn (Quảng Nam).
Tên ông được đặt cho nhiều con đường, nhiều trường học trên khắp Việt Nam. Một giải thưởng của Thành đoàn Thành phố Hồ Chí Minh và một sân vận động ở Cuba cũng đã đặt theo tên ông.